Kwomatografi likid se metòd prensipal la pou teste kontni chak eleman ak enpurte nan matyè premyè, entèmedyè, preparasyon ak materyèl anbalaj, men anpil sibstans pa gen metòd estanda pou konte sou li, kidonk li se inevitab pou devlope nouvo metòd. Nan devlopman metòd faz likid, kolòn kwomatografik la se nwayo kwomatografi likid, kidonk ki jan yo chwazi yon kolòn kwomatografi apwopriye enpòtan anpil. Nan atik sa a, otè a pral eksplike ki jan yo chwazi yon kolòn chromatografi likid soti nan twa aspè: lide jeneral, konsiderasyon ak dimansyon aplikasyon an.
A.Overall lide pou chwazi kolòn likid kwomatografi
1. Evalye pwopriyete fizik ak chimik nan analit la: tankou estrikti chimik, solubilite, estabilite (tankou si li fasil pou soksid / redwi / idrolize), asidite ak alkalinite, elatriye, espesyalman estrikti chimik la se kle a. faktè nan detèmine pwopriyete yo, tankou gwoup la konjige gen gwo absòpsyon iltravyolèt ak fliyoresans fò;
2. Detèmine objektif analiz la: si wi ou non separasyon segondè, efikasite kolòn segondè, tan analiz kout, sansiblite segondè, rezistans presyon wo, lavi kolòn long, pri ki ba, elatriye yo mande;
- Chwazi yon kolòn kwomatografik apwopriye: konprann konpozisyon, pwopriyete fizik ak chimik filler kwomatografik la, tankou gwosè patikil, gwosè pò, tolerans tanperati, tolerans pH, adsorption nan analit la, elatriye.
- Konsiderasyon pou chwazi kolòn kwomatografi likid
Chapit sa a pral diskite sou faktè yo dwe konsidere lè w ap chwazi yon kolòn kwomatografi nan pèspektiv pwopriyete fizik ak chimik kolòn kwomatografi nan tèt li. 2.1 Filler matris
2.1.1 Matris jèl silica Matris filler nan pifò kolòn kwomatografi likid se jèl silica. Sa a kalite filler gen pite segondè, pri ki ba, segondè fòs mekanik, epi li fasil pou modifye gwoup (tankou lyezon fenil, lyezon amine, lyezon cyano, elatriye), men valè pH la ak ranje tanperati li tolere yo limite: la Ranje pH nan pifò filler matris silica jèl se 2 a 8, men ranje pH la nan faz espesyalman modifye jèl silica lye kapab osi lajè ke 1.5 a 10, epi gen tou espesyalman modifye jèl silica faz estokaj ki estab nan pH ba, tankou Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ki estab nan pH 1 a 8; limit tanperati anwo matris jèl silica a se nòmalman 60 ℃, ak kèk kolòn kwomatografi ka tolere yon tanperati 40 ℃ nan pH segondè.
2.1.2 Polymère matris Filler Polymère yo sitou polystyrène-divinylbenzèn oswa polymethacrylate. Avantaj yo se ke yo ka tolere yon ranje pH lajè - yo ka itilize nan seri a nan 1 a 14, epi yo pi rezistan a tanperati ki wo (ka rive pi wo a 80 °C). Konpare ak file C18 ki baze sou silice, sa a kalite filler gen pi fò idrofobi, ak polymère macroporous la trè efikas nan separe echantiyon tankou pwoteyin. Dezavantaj li yo se ke efikasite kolòn nan pi ba ak fòs mekanik la pi fèb pase sa yo ki nan file silica ki baze sou. 2.2 Fòm patikil
Pifò filler HPLC modèn yo se patikil esferik, men pafwa yo se patikil iregilye. Patikil esferik ka bay pi ba presyon kolòn, pi wo efikasite kolòn, estabilite ak lavi ki pi long; lè w ap itilize faz mobil ki gen gwo viskozite (tankou asid fosfò) oswa lè solisyon echantiyon an se gluan, patikil iregilye gen yon pi gwo sifas espesifik, ki se pi plis fezab nan aksyon an plen nan de faz yo, ak pri a se relativman ba. 2.3 Gwosè patikil
Pi piti gwosè patikil la, pi wo efikasite kolòn ak pi wo separasyon an, men pi mal la rezistans presyon ki wo. Kolòn ki pi souvan itilize a se kolòn gwosè patikil 5 μm; si egzijans separasyon an wo, yo ka chwazi yon filler 1.5-3 μm, ki fezab pou rezoud pwoblèm separasyon kèk matris konplèks ak echantiyon milti-konpozan. UPLC ka itilize file 1.5 μm; 10 μm oswa pi gwo file gwosè patikil yo souvan itilize pou kolòn semi-preparatif oswa preparasyon. 2.4 Kontni kabòn
Kontni kabòn refere a pwopòsyon faz estokaj sou sifas jèl silica, ki gen rapò ak sifas espesifik ak pwoteksyon faz lye. Kontni kabòn segondè bay kapasite kolòn segondè ak rezolisyon segondè, epi li souvan itilize pou echantiyon konplèks ki mande separasyon segondè, men akòz tan an entèraksyon long ant de faz yo, tan an analiz se long; kolòn chromatografik kontni kabòn ki ba gen yon tan analiz ki pi kout epi yo ka montre selektivite diferan, epi yo souvan itilize pou echantiyon senp ki mande pou analiz rapid ak echantiyon ki mande pou kondisyon faz akeuz segondè. Anjeneral, kontni kabòn nan C18 varye ant 7% ak 19%. 2.5 Gwosè pò ak zòn sifas espesifik
Medya adsorption HPLC yo se patikil ki mouye, epi pifò entèraksyon yo pran plas nan porositë yo. Se poutèt sa, molekil yo dwe antre nan porositë yo dwe adsorbed ak separe.
Gwosè pò ak sifas espesifik yo se de konsèp konplemantè. Ti gwosè pò vle di gwo sifas espesifik, ak vis vèrsa. Yon gwo sifas espesifik ka ogmante entèraksyon ki genyen ant molekil echantiyon ak faz estokaj, amelyore retansyon, ogmante chaj echantiyon ak kapasite kolòn, ak separasyon konpozan konplèks. Fully pore file fè pati sa a ki kalite file. Pou moun ki gen kondisyon separasyon segondè, li rekòmande yo chwazi file ak gwo sifas espesifik; ti sifas espesifik ka diminye presyon do, amelyore efikasite kolòn, epi redwi tan ekilib, ki apwopriye pou analiz gradyan. Nwayo-koki file fè pati sa a ki kalite file. Sou sit la nan asire separasyon, li rekòmande yo chwazi file ak ti sifas espesifik pou moun ki gen kondisyon efikasite analiz segondè. 2.6 Pore volim ak fòs mekanik
Volim pò, ke yo rele tou "volim pò", refere a gwosè volim anile pou chak patikil inite. Li ka byen reflete fòs mekanik filler la. Fòs mekanik file ak gwo volim pò se yon ti kras pi fèb pase sa yo file ak ti volim pò. Filler ak volim pò mwens pase oswa egal a 1.5 mL / g yo sitou itilize pou separasyon HPLC, pandan y ap file ak volim pò ki pi gran pase 1.5 mL / g yo pwensipalman itilize pou kromatografi esklizyon molekilè ak kwomatografi ba-presyon. 2.7 Pousantaj plafon
Limitasyon ka diminye pik yo ki te koze pa entèraksyon ant konpoze ak gwoup silanol ekspoze (tankou lyezon iyonik ant konpoze alkalin ak gwoup silanol, fòs van der Waals ak lyezon idwojèn ant konpoze asid ak gwoup silanol), kidonk amelyore efikasite kolòn ak fòm pik. . Faz lyezon ki pa kouvri yo pral pwodwi selektivite diferan parapò ak faz lyezon plafon, espesyalman pou echantiyon polè.
- Dimansyon aplikasyon diferan kolòn kwomatografi likid
Chapit sa a pral dekri sijè ki abòde aplikasyon diferan kalite kolòn kwomatografi likid atravè kèk ka.
3.1 Kolòn kwomatografi C18 nan faz ranvèse
Kolòn C18 la se kolòn nan faz ranvèse ki pi souvan itilize, ki ka satisfè tès kontni ak enpurte nan pifò sibstans òganik, epi li aplikab a sibstans ki sou mwayen polè, fèb polè ak ki pa polè. Kalite ak spesifikasyon kolòn chromatografik C18 yo ta dwe chwazi dapre egzijans separasyon espesifik yo. Pou egzanp, pou sibstans ki sou kondisyon separasyon segondè, 5 μm * 4.6 mm * 250 mm espesifikasyon yo souvan itilize; pou sibstans ki gen matris separasyon konplèks ak polarite menm jan an, ka itilize 4 μm * 4.6 mm * 250 mm espesifikasyon oswa gwosè patikil ki pi piti. Pou egzanp, otè a te itilize yon kolòn 3 μm * 4.6 mm * 250 mm pou detekte de enpurte jenotoksik nan celecoxib API. Separasyon de sibstans yo ka rive jwenn 2.9, ki se ekselan. Anplis de sa, anba site la nan asire separasyon, si se analiz rapid obligatwa, yo souvan chwazi yon kolòn kout nan 10 mm oswa 15 mm. Pou egzanp, lè otè a te itilize LC-MS/MS pou detekte yon enpurte jenotoksik nan piperaquine fosfat API, yo te itilize yon kolòn 3 μm * 2.1 mm * 100 mm. Separasyon ki genyen ant enpurte a ak eleman prensipal la te 2.0, ak deteksyon an nan yon echantiyon ka ranpli nan 5 minit. 3.2 Kolòn fenil ranvèse-faz
Kolòn fenil se tou yon kalite kolòn ranvèse-faz. Kalite kolòn sa a gen gwo selektivite pou konpoze aromat. Si repons nan konpoze aromat mezire pa òdinè kolòn C18 se fèb, ou ka konsidere ranplase kolòn nan fenil. Pou egzanp, lè m 'te fè celecoxib API, repons nan eleman prensipal mezire pa kolòn nan fenil nan menm manifakti a ak spesifikasyon nan menm (tout 5 μm * 4.6 mm * 250 mm) te apeprè 7 fwa sa yo ki nan kolòn nan C18. 3.3 Nòmal-faz kolòn
Kòm yon sipleman efikas nan ranvèse-faz kolòn, kolòn nòmal-faz se apwopriye pou konpoze trè polè. Si pik la toujou trè vit lè eliye ak plis pase 90% faz akeuz nan kolòn nan faz ranvèse, e menm tou pre ak sipèpoze ak pik nan sòlvan, ou ka konsidere ranplase kolòn nan faz nòmal. Kalite kolòn sa a gen ladan kolòn hilik, kolòn amine, kolòn cyano, elatriye.
3.3.1 Kolòn Hilic Kolòn Hilic anjeneral entegre gwoup idrofil nan chèn alkyl kole pou amelyore repons lan nan sibstans polè. Kalite kolòn sa a apwopriye pou analiz sibstans sik. Otè a te itilize kalite kolòn sa a lè li te fè kontni an ak sibstans ki gen rapò ak ksiloz ak dérivés li yo. Izomè yo nan yon dérivés xylose kapab tou byen separe;
3.3.2 Kolòn amine ak kolòn cyano Kolòn amino ak kolòn cyano refere a entwodiksyon modifikasyon amino ak cyano nan fen chèn alkyl lye, respektivman, amelyore selektivite a pou sibstans espesyal: pou egzanp, kolòn amine se yon bon chwa. pou separasyon sik, asid amine, baz, ak amid; kolòn cyano gen pi bon selektivite lè separe idwojene ak unhydrogenated estriktirèl sibstans ki sanble akòz prezans nan lyezon konjige. Kolòn amino ak kolòn cyano ka souvan chanje ant kolòn faz nòmal ak kolòn faz ranvèse, men yo pa rekòmande chanje souvan. 3.4 Kolòn chiral
Kolòn chiral, jan non an sijere, se apwopriye pou separasyon an ak analiz nan konpoze chiral, espesyalman nan jaden an nan edikaman. Kalite kolòn sa a ka konsidere lè faz ranvèse konvansyonèl ak kolòn faz nòmal pa ka reyalize separasyon izomè yo. Pou egzanp, otè a te itilize yon kolòn chiral 5 μm * 4.6 mm * 250 mm pou separe de izomè yo nan 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S) -1, 2-diphenylethylenediamine ak (1R, 2R) -1, 2 -diphenylethylenediamine, ak separasyon ki genyen ant de la rive sou 2.0. Sepandan, kolòn chiral yo pi chè pase lòt kalite kolòn, anjeneral 1W + / moso. Si gen yon bezwen pou kolòn sa yo, inite a bezwen fè yon bidjè ase. 3.5 Ion echanj kolòn
Kolòn echanj iyon yo apwopriye pou separasyon ak analiz iyon chaje, tankou iyon, pwoteyin, asid nikleyik, ak kèk sibstans sik. Dapre kalite filler la, yo divize an kolòn echanj kasyon, kolòn echanj aniyon, ak kolòn echanj kasyon fò.
Kolòn echanj kasyon yo gen ladan kolòn ki baze sou kalsyòm ak idwojèn, ki sitou apwopriye pou analiz sibstans kationik tankou asid amine. Pou egzanp, otè a te itilize kolòn kalsyòm ki baze sou lè analize glikonat kalsyòm ak acetate kalsyòm nan yon solisyon flòch. Tou de sibstans yo te gen repons fò nan λ = 210nm, ak degre separasyon an te rive nan 3.0; otè a te itilize kolòn ki baze sou idwojèn lè li analize sibstans ki gen rapò ak glikoz. Plizyè gwo sibstans ki gen rapò - maltoz, maltotriose ak fruktoz - te gen gwo sansiblite anba detektè diferans, ak yon limit deteksyon osi ba ke 0.5 ppm ak yon degre separasyon nan 2.0-2.5.
Kolòn echanj aniyon yo sitou apwopriye pou analiz sibstans anionik tankou asid òganik ak iyon alojene; kolòn echanj kasyon fò gen pi wo kapasite echanj iyon ak selektivite, epi yo apwopriye pou separasyon ak analiz echantiyon konplèks.
Pi wo a se jis yon entwodiksyon nan kalite yo ak aplikasyon chenn plizyè komen kolòn chromatografi likid konbine avèk eksperyans pwòp otè a. Gen lòt kalite espesyal kolòn chromatografik nan aplikasyon aktyèl, tankou kolòn chromatografi gwo-pore, kolòn chromatografi ti-pore, kolòn chromatografi afinite, kolòn chromatografi multimode, kolòn chromatografi likid ultra-wo pèfòmans (UHPLC), kolòn chromatografi likid superkritik. SFC), elatriye Yo jwe yon wòl enpòtan nan diferan domèn. Yo ta dwe chwazi kalite espesifik kolòn chromatografik dapre estrikti ak pwopriyete echantiyon an, kondisyon separasyon ak lòt rezon.
Tan poste: Jun-14-2024